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ELISA试验中常见问题及解决办法

常见问题 2022-01-19359本站admin

ELISA办法被广泛应用于各种抗原和抗体测定,除了盒子自身质量外,操作中很多要素都影响实验的正常成果。zui常呈现的疑问是显色淡,灵敏度偏低、重复性欠安、假阳性成果和假阴性成果,不论呈现什么样的成果,不光客户的**、样本、精力,更主要的是做出了风险判断,在这里咱们剖析ELISA实验非正常检查成果发作的多见要素,并讨论其解决办法,以提高检查质量。

一、重复性较差,常常有客户反响说做了两个复孔值相差太大,也许的疑问有:

 1、样品数量多少纷歧,加样时刻有长有短;所以重复某一样品时,加样时刻尽也许与接近。

 2、保温时刻纷歧致,洗刷条件纷歧致,操作人员纷歧致;重复测定标本,操作条件、人员等应尽也许与上次保持一致,以扫除这些要素构成的纷歧致的也许性。

 3、加样量纷歧致;样品稀释前应充沛混匀,尽也许运用同一移液器并装紧吸嘴。

二、显色淡,灵敏度偏低

1、试剂盒在运送途中时刻太长,温度太高;所以尽量缩短运送时刻,夏日应放冰块降温

2、试剂盒未充沛平衡;所以试剂盒从2~8℃冰箱取出后翻开盒盖,于室温平衡至少20分钟,确保一切试剂已平衡至室温(约25℃)。

3、培养箱温度缺乏37℃,应留意培养箱温度,放入反响板后尽量削减敞开次数以免影响温度安稳,非隔水式培养箱尤其应留意。

4、保温时刻缺乏;所以做实验时必定留意时刻的主要性,假如怕忘了时刻,能够校对守时钟守时。

5、洗刷时冲击力太大、浸泡时刻过长、洗刷次数添加;按说明书请求保留洗刷时刻,记住洗刷次数

6、移液器吸液量缺乏,吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁;所以确保校对移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密,吸嘴内壁要清洁,*一次性运用。

7、蒸馏水水质有疑问,要运用新鲜合格的蒸馏水。

三、假阳性成果和假阴性成果

1、标本的收集与保留

1.1当标本收集保留不妥发作溶血时,红细胞中的血红蛋白释放到血清中,血红蛋白具有过氧化物酶的性质,其经过吸附或“PP效应”(蛋白质间彼此吸附的景象)后,可催化A、B液显色而构成假阳性

1.2标本收集保留不妥致细菌污染,菌体中也许富含内源性HRP,会发作假阳性反响;标本在冰箱中保留时刻过长致使血清IgG聚合,易使间接法的实验本底加深。因而,标本宜在新鲜时检查。

1.3反复冻融血清会使抗体效价下跌,所以测抗体的血清标本如需保留做屡次检查,宜少量分装冻存。

2、加样

2.1假如 样品稀释液少加或血清多加,都会引起本底增高。关于间接法来说,受上述两个要素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占IgG的一小有些。IgG的吸附性很强,非特异性IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异性的IgG均能够和酶标二抗发作反响而构成较高阴性本底或假阳性。假如参加的血清过多,高于规则的稀释倍数,极易构成高值阴性。反之,构成假阴性。

2.2 假如参加的酶物过多或加在较高的孔壁上或孔口,也会引起本底添加或假阳性。

2.3假如血液未开端凝结或凝结不完全时就强行离心别离血清,此刻的血清中仍留有些纤维蛋白原,在ELISA测定过程中能够构成肉眼可见的纤维蛋白块,易构成假阳性成果。

3.  温育

3.1 因为ELISA实验在必定温度下的反响时刻并不是反响的终点,温育时刻过短、温度过低,易致显色不全;温育时刻过长、温度过高,易致非特异性紧附于反响孔周围,难以清洗完全,发作阴性高值或假阳性反响。因而,要严厉按规则的温度和温育时刻进行。

3.2 因为水浴较难将温度控制在安稳的范围,因而咱们每次实验时应仔细调查水浴箱的温度,尽量少敞开水浴箱门,严厉控制水浴的温度为37±0.5。同时,微孔板不可堆叠放置,以确保传热均匀,各板的温度都能敏捷到达平衡。

3.3 因为试剂盒通常设定的反响温度为37度,在这个温度下温育必守时刻,蒸腾的水分会很多,关于全部反响系统来讲,各种反响物的浓度会不断地添加,这么必会致使反响zui终的值添加。因而温育时应贴上封板胶。

4. 洗板

    洗板在ELISA过程中虽不是一个反响过程,但却是决议实验胜败的要害。ELISA就是靠洗板来到达别离游离的和的酶符号物的意图,经过洗板以铲除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体的物质,以及在反响过程中非特异性地吸附于固相载体的搅扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗板时应把这种非特异性吸附的搅扰物质洗刷下来。在ELISA操作中,洗刷是zui主要的要害技术,应严厉按请求洗刷。洗板如不完全,有酶物的非特异性吸附,将使空白值添加。别的,在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净,也将与酶符号抗体作用而发作搅扰。

4.1 各厂家的洗液是依据各自试剂的条件配制的,因而选用不配套的洗液常会得到不正常的反响成果,包含本底添加,所以不一样厂家的洗液不该混用。

4.2 洗液应按规则的倍数稀释运用。试剂盒供给的洗液是浓缩的,过多稀释洗液,会影响洗液的作用,而使反响的本底添加。反之构成假阴性。

4.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水,电导率小于1.5us/cm。假如水中富含过多的钙、镁离子,这些离子会占用表面活性剂,使实验本底增高。

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