ELISA试验中常见问题及解决办法

ELISA办法被广泛应用于各种抗原和抗体测定，除了盒子自身质量外，操作中很多要素都影响实验的正常成果。zui常呈现的疑问是显色淡，灵敏度偏低、重复性欠安、假阳性成果和假阴性成果，不论呈现什么样的成果，不光客户的**、样本、精力，更主要的是做出了风险判断，在这里咱们剖析ELISA实验非正常检查成果发作的多见要素，并讨论其解决办法，以提高检查质量。

一、重复性较差，常常有客户反响说做了两个复孔值相差太大，也许的疑问有：

 1、样品数量多少纷歧，加样时刻有长有短；所以重复某一样品时，加样时刻尽也许与接近。

 2、保温时刻纷歧致，洗刷条件纷歧致，操作人员纷歧致；重复测定标本，操作条件、人员等应尽也许与上次保持一致，以扫除这些要素构成的纷歧致的也许性。

 3、加样量纷歧致；样品稀释前应充沛混匀，尽也许运用同一移液器并装紧吸嘴。

二、显色淡，灵敏度偏低

1、试剂盒在运送途中时刻太长，温度太高；所以尽量缩短运送时刻，夏日应放冰块降温

2、试剂盒未充沛平衡；所以试剂盒从2～8℃冰箱取出后翻开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保一切试剂已平衡至室温（约25℃）。

3、培养箱温度缺乏37℃，应留意培养箱温度，放入反响板后尽量削减敞开次数以免影响温度安稳，非隔水式培养箱尤其应留意。

4、保温时刻缺乏；所以做实验时必定留意时刻的主要性，假如怕忘了时刻，能够校对守时钟守时。

5、洗刷时冲击力太大、浸泡时刻过长、洗刷次数添加；按说明书请求保留洗刷时刻，记住洗刷次数

6、移液器吸液量缺乏，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁；所以确保校对移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，*一次性运用。

7、蒸馏水水质有疑问，要运用新鲜合格的蒸馏水。

三、假阳性成果和假阴性成果

1、标本的收集与保留

1.1当标本收集保留不妥发作溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，其经过吸附或“PP效应”（蛋白质间彼此吸附的景象）后，可催化A、B液显色而构成假阳性

1.2标本收集保留不妥致细菌污染，菌体中也许富含内源性HRP，会发作假阳性反响；标本在冰箱中保留时刻过长致使血清IgG聚合，易使间接法的实验本底加深。因而，标本宜在新鲜时检查。

1.3反复冻融血清会使抗体效价下跌，所以测抗体的血清标本如需保留做屡次检查，宜少量分装冻存。

2、加样

2.1假如 样品稀释液少加或血清多加，都会引起本底增高。关于间接法来说，受上述两个要素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占IgG的一小有些。IgG的吸附性很强，非特异性IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异性的IgG均能够和酶标二抗发作反响而构成较高阴性本底或假阳性。假如参加的血清过多，高于规则的稀释倍数，极易构成高值阴性。反之，构成假阴性。

2.2 假如参加的酶物过多或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底添加或假阳性。

2.3假如血液未开端凝结或凝结不完全时就强行离心别离血清，此刻的血清中仍留有些纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够构成肉眼可见的纤维蛋白块，易构成假阳性成果。

3.  温育

3.1 因为ELISA实验在必定温度下的反响时刻并不是反响的终点，温育时刻过短、温度过低，易致显色不全；温育时刻过长、温度过高，易致非特异性紧附于反响孔周围，难以清洗完全，发作阴性高值或假阳性反响。因而，要严厉按规则的温度和温育时刻进行。

3.2 因为水浴较难将温度控制在安稳的范围，因而咱们每次实验时应仔细调查水浴箱的温度，尽量少敞开水浴箱门，严厉控制水浴的温度为37±0.5。同时，微孔板不可堆叠放置，以确保传热均匀，各板的温度都能敏捷到达平衡。

3.3 因为试剂盒通常设定的反响温度为37度，在这个温度下温育必守时刻，蒸腾的水分会很多，关于全部反响系统来讲，各种反响物的浓度会不断地添加，这么必会致使反响zui终的值添加。因而温育时应贴上封板胶。

4. 洗板

    洗板在ELISA过程中虽不是一个反响过程，但却是决议实验胜败的要害。ELISA就是靠洗板来到达别离游离的和的酶符号物的意图，经过洗板以铲除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体的物质，以及在反响过程中非特异性地吸附于固相载体的搅扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗板时应把这种非特异性吸附的搅扰物质洗刷下来。在ELISA操作中，洗刷是zui主要的要害技术，应严厉按请求洗刷。洗板如不完全，有酶物的非特异性吸附，将使空白值添加。别的，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶符号抗体作用而发作搅扰。

4.1 各厂家的洗液是依据各自试剂的条件配制的，因而选用不配套的洗液常会得到不正常的反响成果，包含本底添加，所以不一样厂家的洗液不该混用。

4.2 洗液应按规则的倍数稀释运用。试剂盒供给的洗液是浓缩的，过多稀释洗液，会影响洗液的作用，而使反响的本底添加。反之构成假阴性。

4.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.5us/cm。假如水中富含过多的钙、镁离子，这些离子会占用表面活性剂，使实验本底增高。